ゲルろ過クロマトグラフィーとSDS-PAGE 100回薬剤師国家試験問115
100回薬剤師国家試験 問115
マウスのある組織から目的のタンパク質を精製し、その性質を明らかにするため、以下の２つの実験を行った。実験方法と考察に関する記述のうち、正しいのはどれか。2つ選びなさい。
【実験１】精製したタンパク質のジスルフィド結合を還元後、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った。ゲル中のタンパク質を染色すると、単一のバンドが観察された。分子量が既知の５種類の標準タンパク質についても同様の操作を行い、図１の結果を得た。
【実験２】精製したタンパク質を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。分子量が既知の６種類の標準タンパク質についても同様の操作を行い、図２の結果を得た。
1 【実験１】では、電気泳動の前に、試料にSDSと2-メルカプトエタノール（2-ME）を含む緩衝液を加えて加熱した。
2 【実験１】のタンパク質の染色には、臭化エチジウム（ethidium bromide）を用いた。
3 【実験２】では、カラムから溶出したタンパク質を検出するため、溶出液の260nm における吸光度を連続的に測定した。
4 【実験１】の結果より、精製したタンパク質の単量体（モノマー）の分子量は、およそ25,000Daと考えられる。
5 【実験１】及び【実験２】の結果より、精製したタンパク質は４量体（テトラマー）として存在すると考えられる。
100回薬剤師国家試験 問115 解答解説
◆ 1について
1 〇 【実験１】では、電気泳動の前に、試料にSDSと2-メルカプトエタノール（2-ME）を含む緩衝液を加えて加熱した。
詳細は下記のリンク先を参照
SDS-PAGEの原理 99回問98の2
◆ 2について
2 ×【実験１】のタンパク質の染色には、臭化エチジウム（ethidium bromide）を用いた。
SDS-PAGEで分離されたタンパク質はクーマシーブリリアントブルー染色や銀染色で検出する。
臭化エチジウム（ethidium bromide）は核酸の塩基対間に挿入されるインターカレーターであり、
DNAやRNAの検出に用いられる。
◆ 3について
3 × 【実験２】では、カラムから溶出したタンパク質を検出するため、溶出液の260nm における吸光度を連続的に測定した。
タンパク質を紫外可視分光光度計で検出する場合は280nmの吸光度を測定する。
280nmである理由は、タンパク質は芳香族アミノ酸残基の芳香環に由来する280nmの吸収極大を持つためである。
なお、核酸(DNA，RNA)を紫外可視分光光度計で検出する場合は260nmの吸光度を測定する（DNA，RNAの吸収極大波長が260nmであるため）。
◆ 4について
4 〇 【実験１】の結果より、精製したタンパク質の単量体（モノマー）の分子量は、およそ25,000Daと考えられる。
SDS-PAGEでは、分子量の常用対数(log10(分子量))と電気泳動の移動度・移動距離の間には直線性がある。
図1の横軸は分子量の常用対数であり、横軸の値より精製タンパク質の分子量は約25000と読める。
SDS-PAGEでは、前処理によりタンパク質の高次構造は壊れ、変性してサブユニット単位（単量体：モノマー）の直鎖状のペプチドとなる。
よって、設問のSDS-PAGEの結果より、
精製したタンパク質の単量体（モノマー）の分子量は、およそ25,000と考えられる。
SDS-PAGEでは、分子量の常用対数(log10(分子量))と電気泳動の移動度・移動距離の間には直線性がある。
図1の横軸は分子量の常用対数であり、横軸の値より精製タンパク質の分子量は約25000と読める。
SDS-PAGEでは、前処理によりタンパク質の高次構造は壊れ、変性してサブユニット単位（単量体：モノマー）の直鎖状のペプチドとなる。
よって、設問のSDS-PAGEの結果より、
精製したタンパク質の単量体（モノマー）の分子量は、およそ25,000と考えられる。
◆ 5について
5 × 【実験１】及び【実験２】の結果より、精製したタンパク質は４量体（テトラマー）として存在すると考えられる。
→ 〇 【実験１】及び【実験２】の結果より、精製したタンパク質は2量体（ダイマー）として存在すると考えられる。
【実験２】の結果より、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィーで分離した目的タンパクの分子量は50,000である。
SDS-PAGEでは、タンパク質の高次構造は壊れ、単量体（モノマー）の分子量が得られるが、実験1より約25,000であった。
一方、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィーでは、高次構造を保ったタンパク質の分子量が得られるが、実験2より約50,000だった。
以上より、目的タンパクは2量体（ダイマー）として存在すると考えられる。
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